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大肠菌群、粪大肠、大肠埃希氏菌检验的相关知识

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1、大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌检验方法
 
(1)大肠菌群(colifoms)
 
一群在36°C培养48h可发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
 
该菌主要来源自人畜粪便,作为粪便污染指标评价食品的卫生状况,推断食品中肠道致病菌污染的可能。
 
 
(2)粪大肠菌群(Fecal colifoms)
 
也称耐热大肠菌群。指大肠菌群中能在44.5C生长、发酵乳糖产生气体的一群细菌。
 
与大肠菌群一样,并非细菌学分类命名,而是卫生细菌领域的用语,它不代表某-一个或某一属细菌,而指的是具有某些特性的-组与粪便污染有关的细菌,这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。
 
食品卫生学意义:作为粪便污染食品的指标菌,MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低
 
作为肠道致病菌污染食品的指针,大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高,但两者之间并不总是呈平行关系。
 
(3)大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
 
分类学概念:肠杆菌科、埃希氏菌属。是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌,是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病,但它侵入人体一些部位时,可引起感染。主要有:
 
■O抗原(菌体抗原,150个)
■K抗原(荚膜抗原,90个)
■H抗原( 鞭毛抗原,50个)
 
 
(4)致泻性大肠埃希氏菌
 
能侵入肠粘膜上皮细胞,引起食物中毒的大肠埃希氏菌。产毒性大肠埃希氏菌(ETEC)-肠胃炎、旅行性腹泻。
 
■致病性大肠埃希氏菌(EPEC)-婴儿腹泻;
■肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)--出血性结肠炎;(O157∶H7;O104∶ H4;O111;O126等)
■侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)—杆菌性痢疾;
■粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)—急慢性腹泻。
 
2、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的关系
 
 
3、相关检验方法标准
 
■GB4789.3-2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数
■GB 4789.38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数
■GB 4789.39- -2013食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数
■GB4789.6- 2016 食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验
■GB4789.36-2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验。
 
4、大肠菌群和粪大肠菌群的检测流程图
 
 
5、大肠菌群计数检验的操作
 
MPN法:
 
 
6、结果报告
 
根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表(MPN:最可能数,基于泊松分布的一种间接计数方法)
 
 
7、WRBA平板计数法
 
 
8、结果报告
 
经最后证实大肠菌群阳性的BGLB试管比例乘以VRBA菌落数再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。
 
 
如:稀释倍数10-3,吸取样品稀释液1ml平板典型或可疑菌落数100挑取10个典型或可疑菌落接种BGLB→阳性6管
 
 
9、大肠埃希氏菌MPN计数法检验程序
 
 
 
10、大肠埃希氏菌在EMB上的菌落形态
 
具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
 
 
11、靛基质试验(呵噪试验)(I)
 
■原理:某些细菌能分解蛋白质生成呵器,呵跺与对二甲基氨基苯醛结合,形成玫瑰呵噪红色化合物。
■培养基:色氨酸肉汤。
 
 
12、甲基红反应(MR)
 
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖,在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸,进一步分解中,由于糖代谢的途径不同,可产生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物,可使培养基PH值下降至pH4.5以下,使甲基红指示剂变红。
 
■培养基:MR-VP培养基。
 
13、V-P试验(VP)
 
某些细菌在葡萄糖蛋白陈水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中氧氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白陈中的肌基生成红色化合物,称V一P(+)反应。
 
36℃±1℃培养48h,加数滴甲基红溶液"
 
 
 
 
14、柠檬酸盐利用试验
 
有的细菌如产气杆菌,能利用柠檬酸钠为碳源,因此能在柠檬酸盐培养基上生长,并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐,使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌,在该培养基上不生长,培养基不变色。
 
15、大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别
 
 
■大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌,发酵乳糖、产酸、产气,IMViC 生化试验为十十——或一十——。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌,其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查 MPN 表(见附录B),报告每 g (mL)样品中大肠埃希氏菌 MPN 值。
 
16、大肠埃希氏菌平板计数法(第二法)
 
 
17、大肠埃希氏菌平板计数
 
(1)选取2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1 mL。同时取1 mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。
 
(2)将10 mL~15 mL冷至45℃±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后,再加3 mL~4 mLVRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板,36 ℃±1℃培养18 h~24 h。
 
(3)选择菌落数在10 CFU~100 CFU之间的平板,暗室中360nm~366 nm波长紫外灯照射下,计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。
 
(4)检验时用已知MUG阳性菌株做阳性和阴性对照。
 
18、大肠埃希氏菌平板计数的报告平板计数的报告
 
两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数,报告每g(mL)样品中大肠埃希氏菌数,以CFU/g(mL)表示。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
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